Penegakkan diagnosis infeksi bakteri dapat dilakukan secara cepat dengan metode isolasi DNA yang telah disederhanakan. Salah satu metode isolasi DNA ialah Heat Treatment yang merupakan metode isolasi DNA sederhana dan ekonomis, namun tingkat deteksi dan kuantifikasi terhadap Bacillus sp. masih belum diketahui. Penelitian ini bertujuan membandingkan kuantitas dan kualitas isolat DNA dari Bacillus sp. dengan berbagai konsentrasi menggunakan metode Heat Treatment dan Filter Based Kit. Metode: Penelitian ini menggunakan metode penelitian eksperimental laboratorium secara in vitro. Sampel jumlah bakteri yang digunakan adalah 10¹ – 10⁴ CFU/ml. Heat Treatment dibandingkan dengan Filter Based Kit berdasarkan Limit of Detection (LoD) and Limit of Quantification (LoQ). Analisa data menggunakan uji ANOVA serta uji Honesty Significant Diference (HSD). Hasil: Yield DNA yang didapatkan Heat Treatment pada konsentrasi terbesar (10⁴ CFU/ml) adalah 5 µg/ml, sedangkan dengan Filter Based Kit adalah 3.67 µg/ml. Nilai LoD Heat treatment dan Filter Based Kit adalah 1.61 µg/ml dan 5.72 µg/ml, sedangkan nilai LoQ Heat treatment dan Filter Based Kit adalah 4.87 µg/ml dan 17.34 µg/ml. Jumlah bakteri yang melebihi nilai LoD dan LoQ Heat treatment adalah 10¹ CFU/ml dan 10⁴ CFU/ml, sementara LoD dan LoQ Filter Based Kit adalah >10⁴ CFU/ml. Kesimpulan: Metode Heat Treatment dapat digunakan untuk isolasi DNA dibandingkan dengan Filter Based Kit.